生物碱类（Alkaloids） 是存在于生物体（主要为植物）中的一类含氮的碱性有机化合物，大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。含生物碱的中草药很多，如三尖杉、麻黄、黄连、乌头、延胡索、粉防已、颠茄、洋金花、萝芙木、贝母、槟榔、百部等。我想在园子里做过中药生物碱研究的战友很多，大家从提取、分离、鉴别（生物碱显色反应，TLC）、含测（酸碱滴定、紫外分光光度法、HPLC等）等各个不同的方面关注着生物碱；做过中药生物碱HPLC指纹图谱的战友都知道，生物碱类的hplc难做，分离度和峰形总不让人满意！希望有经验、有想法的战友到这里来讨论一下，让大家共同进步！做生物碱hplc指纹图谱的关键有：色谱柱的选择，流动相（种类，组成，ph，流速，洗脱梯度等），供试品溶液的制备方法，检测波长（参比波长等）等，还有做LC-MS的注意点等！欢迎大家到次畅所欲言！我正在做HPLC测定延胡索乙素含量。是复方制剂不好做赌注子。0177251 wrote:我正在做HPLC测定延胡索乙素含量。是复方制剂不好做赌注子。可以先对样品进行纯化（大孔树脂，固相萃取小柱），可以除掉大部分的水溶性强的杂质；也可以在你的hplc色谱仪连接预柱，总之达到样品除杂目的就行。我做了一个含生物碱成分的药材,处理样品的时候是直接用乙醇超声的,洗脱时间比较长,峰形看来还可以,就是基线不太平稳.顶一下！嗬嗬，前段时间刚做了一个延胡索乙素的方法学考察，可以说是磕磕绊绊，不过总归是结束了，预柱芯还是要比较频繁的更换的采用氨基柱最好有点忙！顶一下！linhu_1979 wrote:采用氨基柱最好呵呵，赞同，普通的ODS柱不行！要看要做的是哪种生物碱，如果是异甾体类的生物碱，在紫外区是没有吸收的。这类的可以选择蒸发光的检测器（ELSD）。柱子的选择方面主要看你的流动相，如果流动相中要加入二乙胺等碱性试剂的话，要考虑柱子使用的PH值范围，这对保护柱子非常重要。WATERS公司出的有一款杂化颗粒柱，叫X-bridge 适用于PH2－10，应该效果不错。当然，如果提的样品杂质太多，要过SPE（固相萃取），还要加预柱也是要注意的。顶一下！欢迎讨论！如果做半夏应该怎么入手呢？我做过用 离子对色谱法 就可以使用ODS柱了.不过洗柱子时一定要先用水洗哟顶一下！欢迎大家学习、讨论！我给老板做含吗啡的中成药.用了固相萃取,还可以但是流动相的PH老是把握不好.重现性不好,该怎么控制呢???nannanhao wrote:我给老板做含吗啡的中成药.用了固相萃取,还可以但是流动相的PH老是把握不好.重现性不好,该怎么控制呢???我也有同感，流动相的ph很难控制；特别是做hplc指纹图谱时，同一流动相的ph往往难以保证样品中所有组分分离、峰形，不同ph的每张图谱里总会有令人不满意的色谱峰，可谓是众口难调啊；是不是可以考虑将样品按极性、ph分离成不同组分部位，然后分别做各部位的指纹图谱，最终将各部分组合起来对药材进行评价和控制。jingelwang wrote:我做过用 离子对色谱法 就可以使用ODS柱了.不过洗柱子时一定要先用水洗哟先去试试.很实用，学习中。。。近两年做过几味药材的,比较满意.感受如下:1、生物碱不好做。2、曾使用离子对，但基线难稳，重现性不是太好，且耗柱子。3、普通C18柱不太能满足要求。4、选用安捷伦的extend柱，PH在2-11之间，不错。5、WATERS也有类似的柱子，但没用过，听说可以。6、流动相中用三乙胺调节PH，浓度0.06~0.1%。7、梯度洗脱时稳定性好。8、加预柱。njcxsunflower wrote:近两年做过几味药材的,比较满意.感受如下:1、生物碱不好做。2、曾使用离子对，但基线难稳，重现性不是太好，且耗柱子。3、普通C18柱不太能满足要求。4、选用安捷伦的extend柱，PH在2-11之间，不错。5、WATERS也有类似的柱子，但没用过，听说可以。6、流动相中用三乙胺调节PH，浓度0.06~0.1%。7、梯度洗脱时稳定性好。8、加预柱。请问你流动相的水相是？ph通常为？谢谢！近两年做过两种生物碱，总体感觉生物碱的分离比较难，主要问题是易拖尾、分离度差。第一种做的是乌头类生物碱，感觉还是比较好做，用了伊利特的普通C18柱，流动性里加了三乙胺就基本搞定了。第二种也是一味药材中的总碱分离（因为这是我的毕业课题，所以具体的药名我就不说了），目前这种药材差不多已经分离出了20多个生物碱了，而且是在低波长处检测（210nm），所以做指纹图谱相当困难。药典方法是用的氨基柱，但分离效果很不好，只能分出来7-8个峰，估计有多种成分未能完全分离开，基本每个峰都不纯，而且峰形过宽，前伸严重，对称性差。后来曾试过采用大连伊利特ODS2 （250×4.6mm，5μm）色谱柱， DIKMA Inertsil PH-3 （250×4.6mm，5μm）色谱柱， Agilent Eclipse XDB-C18，（250×4.6mm，5μm）色谱柱，资生堂MG Capcell Pak C18（250×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相中加过多种胺类、缓冲盐类，分离效果都很不理想，虽然分离出的峰比氨基柱多了，但峰形很差，并有多个峰不能达到基线分离。最后确定采用Waters XTerra C18色谱柱（150×3.9mm，5μm），流动相中加了盐和氨水，效果很好，基线平稳，灵敏度高，分离度好，达到基线分离。Waters 公司的介绍中提到这款柱子是采用了专利杂化颗粒技术，可以耐受较宽的pH范围（pH 1-12），用于分离生物碱具有较好的峰形，有助于改善碱性化合物的拖尾。（声明一下，本人绝对不是在替Waters公司打广告啊，本人是在校学生来着，只是介绍一下实验心得，因为这些都是我亲手用过的柱子和方法，不过经过摸索我发现Waters的这款柱子真的相当好用。）jiabeixi_2003_1 wrote:请问你流动相的水相是？ph通常为？谢谢！流动相水相是:0.1%三乙胺的水溶液.PH在9.5左右我也在做生物碱的hplc，不过是含测，不是指纹图谱。但是在这个过程中也有很多的问题，结果很不理想。1.查阅了很多资料，有关这两者的高效方法有好些，但绝大部分（可以说是除一两种以外）都用乙腈而不是甲醇做流动相，乙腈的优越点是什么？（如果说是溶剂末端吸收的影响，二者都是205nm啊~）没想通。2.东莨菪碱紫外扫描200~215nm有吸收，大部分的方法都选择210、215nm做检测波长，为什么有的方法用254nm来测呢？我也曾测过一次，只有溶剂峰没有检测到生物碱啊~3.关于流动相中的缓冲盐问题，很多都用的是磷酸盐，我开始也采用磷酸盐，但是没做几次就堵了混合器，而我的盐浓度都才0.0667mol/L，已经很低了呀！后来我换了醋酸铵的缓冲液，但是在215nm的检测波长下仪器报警，流动相吸收值过高！调到230nm后就不会报警，但是对生物碱的检测灵敏度太低。查了醋酸的末端吸收是210nm，用醋酸在这个波长附近就不能做检测吗？是醋酸的影响还是铵离子的影响呢？假如不用缓冲对只是调PH，方法是不是有重现性不好的问题？4.不加缓冲盐的方法也查到有，就是只加离子对试剂。我试了一下，东莨菪碱的峰形还不错，但是出峰太早（4‘前），同时阿托品（9’左右）的峰却是个相当钝的峰，二者产生这么大差别？作者的峰都分得很好啊~我只是离子对浓度比他小点~5.其实我最大的麻烦是该复方中有芦荟，比例很大，而生物碱比例相对很小，所以芦荟中的物质对生物碱影响相当的大，几乎包裹生物碱峰，最好的时候也是与之紧紧相连。如果往后推迟生物碱出峰，那么峰形相当的不好而且分不到基线。为了排除芦荟的干扰，我试了好多前处理方法，不过都用的萃取，结果都不理想。过柱纯化的方法老师说回收率很有问题。各位大侠有没有什么建议呢？6.溴甲酚绿能应用到高效中吗？因为查到一篇用溴甲酚绿显色然后分光光度法测生物碱含量的，我想假如应用到高效中使生物碱吸收波长长移的话，能排除芦荟的干扰吗？不过也很难讲，因为芦荟中有色物质太多了，只是个设想而已。以上就是困扰我很久的问题们，希望各位能予以解答和帮助，不胜感激~~~~前段时间做黄连含量测定，含有20多味药材，用中性氧化铝除杂，用苯基柱，乙腈－磷酸盐缓冲液做流动相，几个生物碱出现五指峰，小檗碱最后一个，每个都达基线分离，对称性也可以，十分钟内走完一针请各位高手解答CindyMiyPark 提出的种种疑问，以便大家共同学习、提高！zwp32880 wrote:前段时间做黄连含量测定，含有20多味药材，用中性氧化铝除杂，用苯基柱，乙腈－磷酸盐缓冲液做流动相，几个生物碱出现五指峰，小檗碱最后一个，每个都达基线分离，对称性也可以，十分钟内走完一针很羡慕，你做的很顺利，有什么经验和大家共享？十分感激！磷酸盐用的是磷酸二氢钾、磷酸、三乙胺调的，346nm测定的。注意一点，就是不同厂家的苯基柱分离效果相差较大，我们用的是Alltima Phenyl(4.6×250mm，5μm )，效果较好，柱子也是不很贵，两三千吧，还合算。zwp32880 wrote:前段时间做黄连含量测定，含有20多味药材，用中性氧化铝除杂，用苯基柱，乙腈－磷酸盐缓冲液做流动相，几个生物碱出现五指峰，小檗碱最后一个，每个都达基线分离，对称性也可以，十分钟内走完一针羡慕你哦，那请教一下过柱的条件呢，因为从来没有走过柱子。最后测得回收率是多少呢？1%盐酸甲醇超声，取续滤液过柱，4倍量甲醇洗脱，我用药材作了一下回收率（注：药材不用过柱也可测定），回收率98%以上，氧化铝对小檗碱基本无吸附，除杂效果相当可以zwp32880 wrote:1%盐酸甲醇超声，取续滤液过柱，4倍量甲醇洗脱，我用药材作了一下回收率（注：药材不用过柱也可测定），回收率98%以上，氧化铝对小檗碱基本无吸附，除杂效果相当可以嗯，好的，谢谢，可以参考一下~贴两张图盐酸小檗碱对照品和成品含量测定的，直接贴不上去，见附件 新建 Microsoft Word 文档 (2).doc (165.0k)嗯，图谱很漂亮！顶！收获不少！查阅了很多资料，有关这两者的高效方法有好些，但绝大部分（可以说是除一两种以外）都用乙腈而不是甲醇做流动相，乙腈的优越点是什么？（如果说是溶剂末端吸收的影响，二者都是205nm啊~）没想通。 首先是乙腈的黏度比甲醇低很多。 其次是在205nm处乙腈的吸光度值大约是0.03，而甲醇大约是1.00，可见在205nm处甲醇的影响比乙腈大多了，所以在通常情况下，如果实验条件允许的话，用乙腈的效果会更好一些（乙腈的价格比甲醇贵）。